原文作者:陳曉南 朱彥

如今在藥物發現的開始階段,會應用基于機制的高通量篩選方法,從具有大于10萬個不同結構的分子庫中篩選活性化合物,緊隨其后會進行嚴格的安全性評價。一般從5 000~10 000個化合物中才能得到一個可以上市的藥物,這需要耗時12~15 a,花費10~20億美元[1]。如果能提早發現某些藥物的毒性作用,就會顯著地降低研發過程中的經濟風險。

目前,藥物的心臟毒性評價主要應用動物模型、動物離體心臟、動物原代心肌細胞及經過修飾的可傳代細胞株H9C2,不僅通量低,而且存在種屬差異。人誘導多能干細胞分化的心肌細胞(hiPSC-CM)與人正常體內心肌細胞的特征相似,克服了種屬間差異,而且可以無限增殖,縮減了藥物研發過程中的時間和成本,為藥物心臟毒性高通量篩選提供了寶貴的生物細胞資源[2-3]。hiPSC-CM已用于高內涵成像、全自動膜片鉗、微電極陣列、實時無標記細胞分析等實驗技術,推動了藥物體外心臟毒性高通量篩選評價方法的發展,也將加快中醫藥現代化進程。


1、hiPSC-CM研究背景

從1990-2013年,美國、歐洲、亞洲總共有81個藥物由于安全問題撤出市場,其中會造成心律失常的藥物就有16個[4]。此外,從1997年至今,由于具有心臟毒性而撤出市場的藥物從5.1%上升到33.3%[5]。由于心毒性是藥物研發過程中導致失敗的重要原因,在藥物發現初期,加強心臟安全性的篩選將會很有幫助。

當前藥物研發過程中,藥物的高淘汰率要歸咎于所用實驗方法檢測結果的不準確性。例如很多毒理實驗用小鼠作為實驗對象,然而小鼠與人之間的種屬差異是非常大的。小鼠的心跳速率是人類的10倍(500 bpm vs 60 bpm),心電圖時程僅是人類的1/5~1/10(50~100 ms vs 450 ms)[6]。小鼠心肌細胞的復極階段由Ito、IK、slow1、IK、slow2、ISS構成,而人類心肌細胞復極階段電流包括IKr、IKs、Ik1等[7]。從分子層面看,調控分子、受磷蛋白和結構基因的表達也存在差異。在人心臟中,α和β肌球蛋白重鏈(α-/β-MHC)分別在心房和心室表達,而α-MHC在小鼠心房和心室中均表達;小鼠肌球輕鏈蛋白MLC2a和MLC2v的分布也不同于人。信號調節蛋白SIRPA只在人體內表達。這些差異使得小鼠對37%的藥物的耐受性要比人類高出10倍[8]。

人類原代心肌細胞的生理環境與體內相似,但是由于來源少、細胞一致性較差、幾乎沒有增殖能力而且體外培養時會去分化,因此不可能得到大規模培養和廣泛應用。人胚胎細胞誘導得到細胞株,如人胚胎腎細胞(HEK)解決了人心肌細胞不能傳代的問題。HEK細胞可以轉染需要研究的藥物靶點,使其在細胞內高表達,從而用于藥物篩選,如hERG通道表達在HEK細胞中用于評價藥物是否會阻斷hERG通道而導致心律失常[9]。來自人體的細胞株雖然解決了種屬差異及不可傳代的難題,但是細胞株所反映的只是藥物與脫離真實環境的通道蛋白的相互作用,并沒有提供藥物作用的更復雜環境。例如,維拉帕米是hERG通道阻滯劑,如果僅以此標準判斷,維拉帕米會被認為是會造成心律失常的藥物,但是由于它同時也會作用于L型鈣通道而不會造成心律失常[10]。這種情況,如果僅應用穩定轉染hERG通道的細胞株進行實驗,也許會淘汰掉一個潛在的有前景的藥物。

因此,科研學者投入相當大的精力探索藥物心臟安全性評價更加可靠的方法,其中就包括hESC-CM和hiPSC-CM。與hESC-CM相比, hiPSC-CM不使用胚胎細胞或卵細胞, 獲得相對容易且不存在倫理學問題,因此更具應用價值和發展前景。


2、hiPSC誘導分化的心肌細胞

誘導多能干細胞(iPSC)最初是日本科學家山中伸彌于2006年利用病毒載體將4個轉錄因子(Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc)的組合轉入分化的小鼠體細胞中,使其重編程而得到的類似胚胎干細胞和胚胎APSC多能細胞的一種細胞類型[11]。2007年他們又利用同樣的技術將人的皮膚成纖維細胞誘導成為hiPSC[12]。hiPSC不僅在細胞的形態、生長特性、干細胞的標志物表達等方面與胚胎干細胞幾乎完全相同,而且在DNA的甲基化方式、基因表達譜、染色質的狀態、形成嵌合體動物等方面也與胚胎干細胞相似。hiPSC可誘導分化為各種細胞,如心肌、神經、胰腺、骨等多種體細胞和不同的組織,用于疾病治療、藥物發現和安全性評價。現在從骨髓、骨骼肌、胎兒和成人心肌、脂肪組織、臍帶組織中都能誘導獲得hiPSC-CM[13],其形態結構、基因表達、離子通道表達量及功能、動作電位和收縮特點與人心肌細胞相似[14]。hiPSC-CM將為心血管領域疾病與藥物研究帶來革命性變化。

心血管疾病和藥物研究需要體外誘導hiPSC分化為心肌細胞,使其獲得與人體心肌細胞相似的自然生理信號通路。誘導hiPSC分化心肌細胞的因素有WNT蛋白家族、轉化生長因子(TGF-β)、成纖維細胞生長因子(FGF)和激活素A(Activin A)等[15-19]。這些細胞因子都會促進hiPSC向心肌細胞分化。也有報道稱化學小分子或有機化合物也會促進hiPSC向心肌細胞分化,如組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑曲古抑菌素A(TSA),抗壞血酸,電刺激或機械刺激[20-22]。從基因表達水平來看,hiPSC-CM的SCN5A、HCN4、CJA1、MYH6、MYH7等心肌特異性基因與人心肌細胞表達量相近[23]。從蛋白表達情況來看,hiPSC-CM表達心肌特異性的因子及結構蛋白。許多必須的收縮蛋白、胞間連接結構、受體、鈣相關蛋白及動作電位中的離子通道都正常表達,比如蘭尼堿受體,心肌肌漿網Ca2+-ATP酶,鈉通道(SCN5A),電壓門控鈣通道(CACNA1C),電壓門控鉀通道(KCN4A和KCNH2)。電生理方面,hiPSC-CM動作電位模式與心肌細胞相同[24]。更重要的是hiPSC-CM對激素刺激有應激,對異丙腎上腺素和氨甲酰膽堿分別有加強和減弱細胞收縮的反應[25]。在CIPA推動下,已有一些研究者將iPSC-CM應用于藥物心臟毒性實驗,與穩定轉染hERG通道的細胞株相比,iPSC-CM能更好的預測藥物誘導的心律失常[26-27]。CIPA的最終目的是要用iPSC-CM代替臨床前動物心毒性評價模型。在不久的將來,iPSC-CM很可能將會在臨床實驗前就將具有心毒性的藥物淘汰掉。因此hiPSC-CM是目前藥物心臟毒性篩選的理想工具。

hiPSC-CM是未成熟的心肌細胞,結構和電生理特性與幼稚型心肌細胞相似。hiPSC-CM的生長培養時在培養皿底,與三維生長的心房心室細胞的復雜結構相比,功能還是相對較弱??蒲Ъ矣τ瞇磯嗷蚧蚍腔蚴侄渭白櫓こ萄У姆椒ㄊ筯iPSC-CM接近成熟狀態[28]。


3、應用hiPSC-CM的藥物心臟毒性高通量篩選方法

在體外藥物心臟安全性評價中,將hiPSC-CM應用到已有或創新的評價方法中需要一定的探索過程。目前已有一些高通量的實驗方法通過檢測hiPSC-CM的表型結構、電生理特征、胞內鈣離子流及收縮性來篩選淘汰掉潛在的心臟毒性化合物。


3.1 高內涵熒光成像

高內涵成像技術可以評價細胞的一系列生理學特征,如細胞數目、細胞形態、細胞增殖、細胞膜完整性、吞噬作用、細胞凋亡、細胞遷移、細胞器健康(如細胞核、線粒體、溶酶體)等。高內涵儀器一般都是高度自動化的,如Opera(Perkin Elmer),ImageXpress(Molecular Devices),BD pathway(BD Biosciences),應用96、384、1 536孔板實現高通量篩選。Mioulane等[29]應用hiPSC-CM和高內涵成像實驗建立了的體外藥物心毒性篩選方法[29]。他們用一組熒光染料Vybrant FAM caspases 3和7、TMRM、ToPRO-3和Hoechst 33342(Invitrogen)檢測細胞核改變、線粒體狀態、細胞凋亡和壞死;可以觀察到hiPSC-CM對藥物白屈菜紅堿濃度依賴的由凋亡到壞死的轉變,以及時間依賴的細胞從凋亡到壞死的形態變化。美國CDI公司應用高內涵成像量化了纈氨霉素,依托泊苷和魚藤酮造成的hiPSC-CM的線粒體和溶酶體生理改變、DNA損傷和氧化應激反應。Sirenko等[30]的工作更加突出,他們應用鈣敏感的熒光染料CalceinAM處理細胞,應用ImageXpress監測細胞內鈣離子流的變化,因為鈣離子的變化與細胞收縮跳動節奏一致,因此可以用來計算跳動次數、跳動幅度及其他參數,同時結合FLIPR監測一些陽性藥如利多卡因、丁卡因抑制鈉通道。硝苯地平,依拉地平,維拉帕米抑制鈣通道及西沙比利,多非利特抑制hERG通道后細胞跳動頻率的變化,實驗結果與文獻報道相近,證實了Sirenko等建立此方法的準確性。而且基于熒光染料的高內涵成像實驗成本低,通量高,每天可產生50 000個數據。以上這些結果說明,hiPSC-CM應用于高內涵成像高通量檢測藥物的心毒性已經成為現實。


3.2 全自動膜片鉗實驗

在過去的10年,全自動膜片鉗逐漸發展起來,技術上取得了很大的進展。除了能夠記錄異源表達的電流,全自動膜片鉗技術還能夠記錄內源性的電流,例如胚胎干細胞(ESC)或者誘導多能干細胞(iPSC)誘導的心肌細胞中的電流[31-32]。Nadine等[31]優化了應用全自動膜片鉗Patchliner(Nanion)記錄iPSC-CM電流的實驗方法,確定了實驗需要的最佳細胞數目。在記錄出hiPSC-CM動作電位后,給予10 μmol/L L型鈣通道的激動劑BayK8644,動作電位延長。10 μmol/L TTX給藥后,沒有動作電位產生,洗脫之后,動作電位恢復正常,證實用Patchliner記錄到hiPSC-CM的電流完全符合電生理特征。Olaf等[33]同樣用全自動膜片鉗驗證了hiPSC-CM的電生理特征。1 μmol/L和10 μmol/L硝苯地平抑制hiPSC-CM動作電位時程APD90至49.8%和40.8%。0.1 μmol/L西沙比利延長APD90至176.2%。10 μmol/L TTX抑制APD90至80.4%。這說明應用全自動膜片鉗開展心臟毒性藥物篩選技術已經成熟。

目前,自動膜片鉗的結果還不能達到手動膜片鉗那樣精確,它自動封接細胞及自動加藥系統使得每天能產生10 000個數據[34]。對于操作熟練的實驗人員,全自動膜片鉗的成功率會達到60%~80%,對于缺乏經驗的操作者,成功率低于50%也并不稀奇。實驗失敗的原因一般歸結于細胞質量,包括細胞膜的性質,細胞消化的質量以及細胞表達目的通道的百分率。全自動膜片鉗需要消化細胞,這樣也許會破壞細胞間網絡,是否會改變hiPSC誘導的心肌細胞的離子電流目前仍無定論。


3.3 微電極陣列場電位測量

微電極陣列(MEA)標測技術是一種中通量的實驗手段,用來測量多細胞的場電位。心電圖Q-T間期延長是預示致心律失常危險的重要指標, 而心室肌細胞動作電位時程或應用MEAs技術記錄到的細胞外場電位時程(FPD)能直接反映Q-T間期延長狀況。實驗證明場電位時程和動作電位時程密切相關[35]。微電極陣列標測技術已經成功應用于hiPSCs誘導的細胞來預測QT間期延長和心律失常[26]。8個工具藥(hERG通道阻滯劑:E-4031、西沙比利;hERG和鈉通道阻滯劑:氟卡尼、美西律、奎尼丁、特非那定;鈣通道阻滯劑:硝苯地平、維拉帕米)用MEA方法研究對hiPSC-CM離子通道的抑制作用并和已存在和研究數據進行比較[27]。這項研究表明,基于hiPSC-CM的MEA實驗數據與目前功能心臟電生理數據一致,這種實驗方法提供了可靠的藥物心毒性高通量篩選策略。

微電極陣列實驗可以長時間、同步標測多細胞標本的電活動情況, 對于研究細胞間電信號的傳導機制問題具有一定的優勢。彌補了膜片鉗技術存在的不足(研究多局限于單個心肌細胞,不能反映細胞間電活動傳導狀況,對細胞而言有創,難以進行長時程檢測),可在組織水平上完成心臟生理和病理狀態下電激動傳導方面的實驗研究。


3.4 實時無標記細胞分析技術

實時無標記細胞分析技術(RTCA)是一種建立在阻抗基礎上的瞬時細胞電感應連續記錄系統,能夠無標記的檢測心肌細胞的收縮周期,動態監測心肌細胞的收縮性,能夠靈敏定量地檢測到心肌功能的離子和非離子通道調節器的效應,因此可以用來評估某些藥物的臨床前心臟安全性,也為篩選出潛在的心臟毒性藥物提供了一種相對高通量和方便的途徑。一項實驗研究應用人類iPSC誘導的心肌細胞檢測49個陽性藥、陰性藥物及空白對照在RTCA實驗對心肌細胞收縮的影響,結果顯示空白對照的可信度為74%,陽性藥的可信度為78%,陰性藥物的可信度為95%[36],根據歐洲實驗代替方法的驗證標準(European Centre for the Validation of Alternative Methods criteria),RTCA實驗具有很好的預測能力。正是應用RTCA實驗發現了阿霉素降低心臟跳動頻率,從而進一步研究發現阿霉素會影響線粒體功能[37]。

與MEA實驗相同,RTCA可以在細胞正常培養的條件下進行實驗,無需對細胞消化處理等步驟。在最接近生理狀態下很快獲得檢測結果。自動連續檢測,可獲取全過程動態信息,實驗方法簡單易行,實驗參數相對較少,數據處理快速方便。


4、展望

藥物研發的不同階段,心臟毒性是導致藥物研發失敗的重要原因?;趆iPSC-CM的藥物心毒性高通量篩選技術逐漸成熟,將大大減少藥物研發的成本,提高藥物研發效率。

中藥是中華民族長期積累沉淀下來的寶貴財富,中藥新藥研究是個高投入、高風險的行業,由于中藥具有量效關系復雜、多靶點等特征, 使得中藥很難擺脫粗、大、黑的禁錮[38]。目前中國中藥新藥研制的整體水平不高,忽視了發展創新和基礎研究[39-40]。運用高新技術手段探討中藥作用的物質基礎、作用機制及毒性反應監測是中藥新藥研究的發展趨勢。目前基于hiPSC的中藥研究還沒有報道,將hiPSC應用于中藥新藥及大品種二次開發研究中,使現有的動物證候模型不斷趨向人的證候模型改進,hiPSC有分化為各種人體細胞的潛能,將基于hiPSC藥物研發和篩選技術應用于天然藥物研究, 既是對hiPSC技術應用的完善, 又是將這一技術應用于天然藥物研究的有益嘗試[41]。

辨證論治是中醫特色和優勢所在,中藥新藥的臨床療效如何,取決于對證候治療的效果,但目前缺乏針對證候治療的有效手段。目前心血管疾病的精準醫療和心臟毒性個體化辨識均可獲益于hiPSC技術的完善和推廣[42]。從患者獲得的hiPSC可產生大量受該疾病影響的細胞,這些細胞可用于構建體外疾病模型, 許多疾病特異性的細胞系已被成功建立,如擴張型心肌病,肥厚型心肌病,致心律失常性右室心肌病,Duchenne型肌營養不良癥,糖尿病心肌病,ALDH2缺乏癥,心肌炎[43-49]。充分利用中醫藥的理論及實踐基礎,基于hiPSC的體外疾病模型定會為中醫辨證論治理念指導下精準醫療提供新思路。


2018年11月06日

上一篇:

下一篇:

hiPSC-CM在中藥早期心臟毒性篩選和上市后安全性再評價中的應用展望

添加時間:

本網站由阿里云提供云計算及安全服務